《马里奥与路易RPG2》的故事仍然发生在大家熟悉的蘑菇王国，只不过时间有所不同。不知为何，马里奥与路易发现他们被传送到过去，并遇到了少年时代的马里奥与路易，4人同心协力（这也是日版取名2*2的原因）从神秘的异国力量的威胁下在一次拯救了蘑菇王国。
在游戏中现在的马里奥、路易与小马里奥、小路易4人将同时登场，并利用NDS的双屏，上屏幕显示小马里奥和小路易，而下屏幕显示马里奥与路易。游戏的整个过程中都要通过双方的巧妙配合才可以解开一个个谜题。而新角色大恐龙“盖西”（难道是耀西朋友？），总是处于饥饿状态，身形巨大的它一口就能将耀西吞进肚子里。
在前作中马里奥直接使用大锤进行攻击，而本作中由于身背小马里奥，所以就由小马里奥手持大锤，马里奥攻击时将小马里奥联同大锤一起对敌人进行攻击，这使攻击的威力比前作有所增强。同样由于身背小马里奥使得重量增加，所以本作中跳跃攻击的威力也比前作大的多。另外，在放下小马里奥后，马里奥可以对敌人进行连续的跳跃攻击。
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